细菌利用CRISPR-Cas 适应性免疫系统切割噬菌体等移动遗传元件(mobile genetic elements，MGEs)，保护自身遗传信息的完整性。CRISPR 相关的基因编辑工具以其高效、简便等优势成为生命医学领域最前沿的技术之一。在细菌-MGEs互作的博弈与协同进化过程中，MGEs也进化出了抗CRISPR蛋白（anti-CRISPR proteins，Acrs）抑制CRISPR-Cas系统。最近有报道指出，一些非噬菌体来源的Acrs，如AcrIIA17和AcrIIA18，可以通过调节sgRNA来抑制Cas9蛋白活性【1】，但其抑制机制尚不清楚。
近期，天津医科大学张恒教授课题组在Nucleic Acids Research杂志上发表了题为：Inhibition mechanisms of CRISPR-Cas9 by AcrIIA17 and AcrIIA18的文章，详细阐释了AcrIIA17和AcrIIA18抑制CRISPR-Cas系统的机制。
CRISPR-Cas系统由成簇间隔短回文重复序列(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)和CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated protein，Cas)组成，是细菌和古细菌的适应性免疫系统，用于抵抗外来移动遗传元件的入侵。CRISPR-Cas系统可以分为六种类型【2】,其中基于II型CRISPR-Cas9系统的基因编辑技术已被广泛用于基础研究和转化应用。到目前为止，已经发现了二十多种靶向Cas9系统的Acrs蛋白，它们分别在不同阶段以不同的方式抑制Cas9系统。其中一些主要通过结合Cas9并阻碍其发生必需的构象变化来抑制CRISPR-Cas9系统，例如，AcrIIA14、AcrIIC1和AcrIIC3结合Cas9的HNH核酸酶结构域，使其处于无催化活性的构象。还有一些Acrs通过模仿PAM序列，结合Cas9，阻止底物DNA结合。与之前发现的II型Acrs不同，AcrIIA17-18大部分来源于非噬菌体，并通过调控sgRNA来抑制CRISPR-Cas系统【1】。
为了研究AcrIIA17的调控机制，作者使用AlphaFold2预测了AcrIIA17的结构，并通过DNA切割和EMSA等体外生化实验验证AcrIIA17与Cas9之间的相互作用，发现AcrIIA17与NmeCas9的作用强于SpyCas9。利用pull down和ITC实验，作者发现AcrIIA17通过与NmeCas9的BH结构域结合，阻碍了Cas9-sgRNA核糖核蛋白(ribonucleoprotein, RNP)复合物的组装，最终抑制CRISPR-Cas9系统（图一）。
图一
为了研究AcrIIA18的抑制机制，作者首先通过X射线晶体学方法解析了AcrIIA18的高分辨率晶体结构。AcrIIA18包含一个N末端结构域(N-terminal domain, NTD)和一个C末端结构域(C-terminal domain CTD)。由于暴露在溶剂中的带电残基可能参与底物结合和催化，作者在NTD和CTD结构域表面选择了13个带电残基进行点突变和功能评估，发现NTD上的V形口袋对AcrIIA18发挥抑制作用至关重要。通过体外RNA切割等一系列生化实验，作者发现AcrIIA18可以将sgRNA的spacer区域切割至15nt，切割后的sgRNA不足以激活Cas9的内切酶活性，从而抑制CRISPR-Cas9系统（图二）。
图二
综上所述，该研究从生物化学与结构生物学的角度阐释了AcrIIA17和AcrIIA18抑制CRISPR-Cas9系统的分子机制。AcrIIA17与Cas9的BH结构域结合，抑制Cas9-sgRNA核糖核蛋白(RNP)复合物的组装；AcrIIA18则通过切割sgRNA，抑制CRISPR-Cas系统。该研究结果不仅为II型Acrs抑制CRISPR-Cas9系统的机制提供了新的见解，并且可能为开发CRISPR-Cas9系统调控工具提供理论依据。
天津医科大学基础医学院张恒教授和银行博士为本文共同通讯作者，2021级博士生王枭燊和李徐梓超为本文的共同第一作者。该工作得到了上海同步辐射光源的帮助和支持。
参考文献：
【1】Mahendra, C., Christie, K.A., Osuna, B.A., Pinilla-Redondo, R., Kleinstiver, B.P. and Bondy-Denomy, J. (2020) Broad-spectrum anti-CRISPR proteins facilitate horizontal gene transfer. Nature microbiology, 5, 620-629.
【2】Mohanraju, P., Makarova, K.S., Zetsche, B., Zhang, F., Koonin, E.V. and Van der Oost, J. (2016) Diverse evolutionary roots and mechanistic variations of the CRISPR-Cas systems. Science, 353.
原文链接：https://doi.org/10.1093/nar/gkab1197
【作者介绍】
张恒
天津医科大学基础医学院教授、博导。2020年9月加入天津医科大学建立结构生物化学实验室。张恒博士从事基因转录、编辑及病原菌入侵宿主相关的蛋白质结构功能研究。近五年来，张恒博士发表SCI论文14篇；其中通讯作者3篇，包括Nature Structural & Molecular Biology、Nucleic Acids Research（2篇）；第一作者论文9篇，包括Cell Host & Microbe、Nature Chemical Biology （2篇）、Proc Natl Acad Sci USA（PNAS）、Genes & Development、Cell Research和Cell Reports等。
